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PCR是分子生物學(xué)的常規(guī)和常用手段，用途很多，但是都是通過擴(kuò)增目的基因片段來實(shí)現(xiàn)的。
那么，首先需要搞明白的是，需要擴(kuò)增的基因片段大小是多大，因?yàn)椴煌笮〉幕蚱纹鋽U(kuò)增的難度是有差異的，尤其過長(zhǎng)的片段，需要使用不同的taq酶來進(jìn)行擴(kuò)增（比如LA taq）。幾點(diǎn)容易發(fā)生問題的地方供參考：
1.引物，PCR是基于引物來實(shí)現(xiàn)的。引物是否是自己設(shè)計(jì)的？如果是，需要檢查一下引物設(shè)計(jì)的是否合理。如果是從文獻(xiàn)中選取的，一般出問題的可能性不大，不放心的可以在數(shù)據(jù)庫比對(duì)一下，防止文獻(xiàn)出錯(cuò)。
2.模板，一般來講通過試劑盒提取的DNA質(zhì)量都是可以保證的，也能在4℃冰箱放置較長(zhǎng)的時(shí)間，仍能進(jìn)行PCR擴(kuò)增。要是通過煮沸法粗提的DNA就沒辦法放置太長(zhǎng)時(shí)間了。一句話就是，模板DNA的濃度要合適。
3.反應(yīng)條件，這一塊就比較復(fù)雜了，特別是對(duì)自己設(shè)計(jì)的引物來說，選擇合適的退火溫度，是需要慢慢摸索的，一般根據(jù)計(jì)算的退火溫度降低5~10℃來進(jìn)行首chi擴(kuò)增，如果出現(xiàn)了目的條帶，且有雜帶時(shí)，在逐步提高退火溫度，以提高反應(yīng)的特異性。
此外，還有反應(yīng)體系，電泳條件等等因素。
