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小核酸轉(zhuǎn)染試劑

簡(jiǎn)要描述:

小核酸轉(zhuǎn)染試劑公司正在出售的產(chǎn)品:人正常睪丸細(xì)胞 巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2( GRO β)封閉多肽 馬乳頭瘤病毒PCR檢測(cè)試劑盒 大鼠血管緊張?jiān)?aGT)試劑盒 ELISA 外切β1,4葡聚糖/纖維二糖水解(C1)活性比色法檢測(cè)試劑盒 教堂小短桿菌 尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子4抗體

更新時(shí)間:2024-01-14

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小核酸轉(zhuǎn)染試劑

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小核酸轉(zhuǎn)染試劑

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A-Tq3001

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PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對(duì)PCR造成影響,故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品:

馬皰疹病毒通用染料法熒光定量PCR試劑盒

STAT3蛋白抑制分子ELISA試劑盒 PIAS3免費(fèi)代測(cè)試劑

人腺病毒D43型探針法熒光定量PCR試劑盒

比氏腸微孢蟲PCR檢測(cè)試劑盒直銷

動(dòng)力蛋白激活蛋白1ELISA試劑盒 DCTN1免費(fèi)代測(cè)試劑

反芻獸曼氏桿菌PCR檢測(cè)試劑盒直銷

豬瘟病毒/豬藍(lán)耳病病毒通用型(CSFV/PRRSV-U)核檢測(cè)試劑盒

防御β113ELISA試劑盒

魯氏不動(dòng)桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

牛皰疹病毒3PCR檢測(cè)試劑盒

端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2ELISA試劑盒

輪狀病毒B群染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

綿羊星狀病毒1型染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

二羥基激2ELISA試劑盒

腦膜炎黃桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

牛丘疹性口炎病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

泛醌蛋白1ELISA試劑盒

人星狀病毒(HastV)核檢測(cè)試劑盒

牛腎盂腎炎棒桿菌PCR檢測(cè)試劑盒

防御α3ELISA試劑盒

青蒿探針法PCR鑒定試劑盒

綿羊腺病毒PCR檢測(cè)試劑盒

紡錘體蛋白1ELISA試劑盒

口蹄疫病毒2亞型PCR檢測(cè)試劑盒供應(yīng)

綿羊皰疹病毒型PCR檢測(cè)試劑盒

分揀連接蛋白1ELISA試劑盒

槍狀肝吸蟲PCR檢測(cè)試劑盒供應(yīng)

牛皰疹病毒通用PCR檢測(cè)試劑盒供應(yīng)

鈣蛋白12ELISA試劑盒

流感嗜血桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

駱駝痘病毒PCR檢測(cè)試劑盒說明書

人丙酰羧化β多肽(PCCB)ELISA檢測(cè)試劑盒

禽沙門氏菌探針法熒光定量PCR試劑盒

納米小孢子菌探針法熒光定量PCR試劑盒

小鼠γ干擾(IFN-γ)試劑盒elisa

甲型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

紅斑丹毒絲菌(豬丹毒桿菌)探針法熒光定量PCR試劑盒

β膠原交聯(lián)(bCTx)ELISA試劑盒

沙門氏菌通用PCR檢測(cè)試劑盒

滑液支原體PCR檢測(cè)試劑盒

人白介-1β前體(Pro-IL-1β)ELISA試劑盒

小核酸轉(zhuǎn)染試劑緊密著色霉探針法熒光定量PCR試劑盒

小反芻獸疫通用型和野毒株(PPR-U/ PPR-W)雙重核檢測(cè)試劑盒

人蛋白聚糖(PG)ELISA試劑盒

球孢白僵菌PCR檢測(cè)試劑盒

 


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